Fluoreszenz in der PCR-Diagnostik

Die PCR-Diagnostik ermöglicht es, DNA nachzuweisen und zu sequenzieren. Die RT-PCR wird verwendet, um RNA zu detektieren bzw. sequenzieren. Hierfür wird in einem ersten Schritt die RNA mit Hilfe der reversen Transkritase in DNA übersetzt um, sie dann bei der Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) zu vervielfältigen. Schließlich werden die DNA-Abschnitte sequenziert.

von Dr. Jakob Bierwagen, AHF analysentechnik AG

Basen-Markierung mit Fluoreszenzmarkern

Für die Sequenzierung stehen vielfältige Methoden zur Verfügung. Die Markierung der einzelnen Basen geschieht hierbei meist mit Fluoreszenzmarkern. Die klassische Methode nach Frederick Sanger (1918–2013, Nobelpreis 1980) funktioniert so, dass ausgehend von einem (kurzen) bekannten Abschnitt (Primer) der komplementäre Strang durch die PCR verlängert wird. Wie bei der „normalen“ Vervielfältigung wird die DNA-Doppelhelix durch Erhitzen getrennt. Die Einzelstränge werden nun in vier Ansätze aufgetrennt. In den vier Ansätzen ist eine Base fluoreszenzmarkiert. Zusätzlich wird in jeden der vier Ansätze ein wenig Didesoxynukleotidtriphosphat (ddNTP) hinzugegeben, also eine doppelt desoxygenierte Base. Diese nichtnatürliche DNA-Base führt bei Einbau während der Polymerase-Kettenreaktion zum Abbruch der Kettenreaktion, da es keine OH-Gruppe in der 3‘-Position enthält. Wird also diese Base während der PCR eingebaut, endet die Kettenreaktion für dieses Molekül an dieser Stelle. Dadurch entstehen unterschiedlich lange Fragmente des komplementären DNA-Strangs, die in jedem der vier Ansätze jeweils bei der gleichen Base (A, C, G oder T) abbricht.

Auftrennung der DNA-Fragmente mit Gelelektrophorese

Nach dieser Sequenzierungs-Reaktion, die wie die PCR durchgeführt wird, befinden sich in den vier Ansätzen unterschiedlich lange DNA-Fragmente, die mit Hilfe von Gelelektrophorese nach der Länge/Gewicht aufgetrennt werden. Mit dem Vergleich der vier Ansätze (durch Sichtbarmachung der Fluoreszenz) kann die (komplementäre) Sequenz abgelesen werden.

Auftrennung mit Kapillarelektrophorese

Heutzutage werden die vier verschiedenen ddNTPs mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Dies erlaubt es, alle vier ddNTPs in einem Reaktionsgefäß zuzugeben und auf die Auftrennung in die vier verschiedenen Ansätze zu verzichten. Statt einer Gelelektrophorese wird durch eine Kapillarelektrophorese aufgetrennt, die durch Laserstrahlen durchgeht. Die verschieden schweren Fragmente werden dann nacheinander angeregt und jedes Fragment zeigt durch Fluoreszenz in einer anderen Farbe die entsprechende Base an. Die Abfolge der Farbsignale gibt also direkt die Sequenz der Basen wieder.

Detektion mit Fluoreszenz weiter relevant

Daneben gibt es inzwischen Sequenzierungsmethoden der zweiten und dritten Generation, die hoch komplex und automatisiert sind und teilweise auf Einzelmolekülbasis funktionieren, jedoch weiterhin die Fluoreszenz als Detektionsmöglichkeit verwenden.

Hochselektive Filter notwendig

Für die Detektion des Farbcodes durch die Fluoreszenzmoleküle werden hochselektive optische Filter (>OD6) benötigt. Da nur geringste Mengen detektiert werden, müssen diese auch eine sehr gute Transmission von >95% aufweisen. Deswegen kommen in diesem Bereich nur optische high-end Filter in Frage, die AHF analysentechnik im Portfolio hat. Wir beraten sie gerne auch bezüglich dieser und vieler weiterer Anwendungen für Fluoreszenzfilter.