Wie funktionieren optische Strahlenteiler (Strahlteiler)?

Ebenheit von Strahlenteiler (Strahlteiler)

Mikroskope und generell optische Aufbauten bestehen aus diversen optischen Komponenten, wobei die Leistung des Systems (Auflösung, Kontrast, etc.) aufgrund von Wellenfrontfehlern negativ beeinträchtigt werden kann.

Wellenfrontfehler entstehen immer, sobald die Oberfläche einer optischen Komponente von der jeweiligen idealen Form abweicht. Um den Wellenfrontfehler zu beschreiben, geht man von einer ebenen Wellenfront (Fläche mit gleicher Phase der Welle) aus, die sich i.d.R. orthogonal zur Ausbreitungsrichtung bewegt. Diese Wellenfront wird aufgrund der nicht idealen Oberfläche von optischen Komponenten deformiert. Zwei Arten werden dabei unterschieden:

  • Reflektierter Wellenfrontfehler (RWE = Reflected Wavefront Error),
  • Transmittierter Wellenfrontfehler (TWE = Transmitted Wavefront Error)

Bei immer mehr hochauflösenden Mikroskopiemethoden wie TIRF, STED, etc. spielt die Reduzierung des Wellenfrontfehlers im System eine entscheidende Rolle. Daher sollte bei der Wahl eines optischen Filters bzw. Strahlenteilers die Ebenheit der optischen Komponente der Anwendung entsprechend spezifiziert und ausgewählt werden, um die Leistung des Systems nicht zu beeinträchtigen.

Reflektierter Wellenfrontfehler von Strahlenteiler (Strahlteiler) – RWE

Beim reflektierten Wellenfrontfehler (RWE) betrachtet man die an einer Oberfläche reflektierte Wellenfront und den dabei entstandenen Fehler. Auf die reflektierte Wellenfront wirken sich dabei primär die Krümmung (konvex, konkav) und die Unebenheiten des Strahlenteilers negativ aus. Der um 180° reflektierte Strahl bekommt dabei eine doppelt so große Abweichung wie der Abstand des Oberflächenfehlers (Ebenheit) des Strahlenteilers aufgrund des doppelten Weges. Bei Reflektionen ungleich 180° wird der reflektierte Wellenfrontfehler mit dem Cosinus des Einfallswinkels zur Normalen der Fläche multipliziert:

RWE = 2 * Ebenheit* cos(AOI)

Um die Auswirkung eines nicht ebenen Strahlenteilers zu veranschaulichen, betrachten wir die Reflexion eines Lasers an einem gekrümmten (A) bzw. flachen (B) Strahlenteiler und das erzeugte Bild an der Wand bzw. Decke.

Abb.1:  © Semrock Optical Filters – IDEX Health & Science

Abb. 2:  © Semrock Optical Filters – IDEX Health & Science

Transmittierter Wellenfrontfehler von Strahlenteiler (Strahlteiler) – TWE

Beim transmittierten Wellenfrontfehler (TWE) betrachtet man die nicht mehr ideale Wellenfront nach dem Durchgang durch ein optisches Medium (Linse, Strahlenteiler, optischer Filter, etc.), wobei sich der Fehler aus der Summe der Fehler beider Oberflächen (Vorder- und Rückseite) zusammensetzt. Den gesamten Wellenfrontfehler kann man dabei in einen Keilfehler (nicht parallele Flächen), einen sphärischen, gekrümmten Anteil (konkave / konvexe Linse) und einen diffusen, nichtregelmäßigen Anteil einteilen. In der Regel ist der durch Transmission erzeugte Wellenfrontfehler relativ klein und kann vernachlässigt werden.

Abb. 3:  © Semrock Optical Filters – IDEX Health & Science

Wie spezifiziert man die Ebenheit von Strahlenteiler (Strahlteiler)?

Die Spezifizierung der Ebenheit von Strahlenteiler ist leider nicht einheitlich, weshalb man beim Vergleichen der Ebenheit von unterschiedlichen Herstellern gut hinschauen muss. Generell wird aber die Abweichung bzw. der Fehler in der Einheit einer Referenzwellenlänge (632,8 nm in der ANSI-Norm und 546,07 nm in der ISO-Norm) über eine definierte Fläche (meist kreisrunde Fläche mit Durchmesser 1 Zoll = 25,4 mm) angegeben.

PV oder Peak-to-Valley

Bei der Bezeichnung Peak-to-Valley (PV, Berg bis Tal) bezieht sich die Spezifizierung der Unebenheit auf die Differenz der höchsten zur niedrigsten Stelle innerhalb einer definierten Fläche (1 Zoll oder der freien Apertur). Berücksichtigt werden muss außerdem, was genau spezifiziert wird: die Unebenheit des Objekts oder die reflektierte / transmittierte Wellenfront. Der reflektierte Wellenfrontfehler ist dabei bis zu doppelt so groß wie die Unebenheit der reflektierenden Oberfläche und ist abhängig vom Einfallswinkel. Der transmittierte Wellenfrontfehler setzt sich aus der Vorder- und Rückseite zusammen – wobei dieser kleiner sein kann als die Summe der einzelne Fehler einer Oberfläche.

RMS

Die Spezifizierung "Root Mean Square“ wird auch Quadratischer Mittelwert (QMW) oder Effektivwert genannt. Bei einer einfachen Form (nur „positive“ Abweichungen, wie bei einer „Salatschüssel“) beträgt der RMS-Wert in etwa 70% des „PV“-Wertes. Bei einer unregelmäßigen Abweichung, wie bei einem „Kartoffel-Chip,“ sinkt dieser Wert auf ca. 30%. Wenn der Oberflächenfehler eher einer Mondoberfläche gleicht, betrachtet man die vielen unterschiedlichen Unebenheiten separat, quadriert sie jeweils, summiert sie zusammen, teilt sie durch die Anzahl der Unebenheiten und nimmt final noch die Wurzel daraus (die alternative Darstellung drückt es etwas eleganter aus, t entspricht hierbei x):

Formel für QMW

Der RMS-Wert ist dann geeigneter, wenn der Oberflächenfehler sich aus unterschiedlichen oder sehr punktuellen Unebenheiten zusammensetzt und nicht gleichförmig ist. Für die Rauigkeit einer Oberfläche eignet sich daher der RMS besser. Um die „Verformung“ einer nicht flachen (aber möglicherweise glatten) Oberfläche zu beschreiben ist der PV-Wert oder Krümmungsradius geeigneter.

Gedankenexperiment: Was tun, wenn man lediglich an einer Stelle ein tiefes, kleines Loch hat (z.B. Pinhole)?

Wenn man gemäß „PV“ die Differenz aus der höchsten zur tiefsten Stelle über eine Fläche (die deutlich größer ist) nimmt, wird der Filter als sehr uneben spezifiziert und die vielleicht restliche sehr gute Ebenheit vernachlässigt. Schade drum. Bei optischen Filtern und Strahlteilern sind kleine Löcher und Kratzer keine Seltenheit und werden gemäß Scratch/Dig spezifiziert.

Der Vorteil am RMS Wert ist: es wird die Unebenheit im Gesamten versucht zu erfassen. Der Nachteil ist: er ist nicht so leicht zu ermitteln und weniger anschaulich bzw. verständlich.

Krümmungsradius

Mathematisch gibt die Krümmung (κ) die lokale Abweichung von einer Geraden an und ist umgekehrt proportional zum Radius (R):

R = 1 / κ

Aufgrund der (einigermaßen symmetrischen) Krümmung der Strahlenteiler entsteht ein Fokus, so dass ein kollimierter Strahl einen Brennpunkt besitzt. Der Abstand zum Brennpunkt entspricht dabei dem halben Radius der Krümmung der Oberfläche. (Näherung: Sphärischer Spiegel, achsennahe Strahlen).

Herstellung von flachen Strahlenteiler (Strahlteiler)

Wellenfrontfehler entstehen zum einen aus den Spannungen (Stress), die aufgrund der Beschichtung von den vielen Schichten mit unterschiedlichem Material und Dicke entstehen und zum anderen aufgrund von Beschichtungsunregelmäßigkeiten bzw. „weitergegebenen“ Substratoberflächenfehlern. Der erste Fehler erzeugt eine Krümmung wie eine Art Parabolspiegel („Salatschüssel“) und der andere Fehler eine Art Mondoberfläche.

Um die Zusammenhänge aufzuzeigen, betrachten wir den durch die Beschichtung erzeugten Stress, der die Krümmung verursacht (δ in µm), den Durchmesser (freie Apertur) der betrachteten Fläche (D in mm), die Beschichtungsdicke (f in µm, wobei bei doppelseitigen Beschichtungen die Differenz betrachtet wird), die Substratdicke (s in mm) und eine dimensionslose Konstante C (abhängig vom Glastyp, Beschichtungsmaterial, etc.):

Formel für Beschichtungskrümmung

Daraus ergibt sich, dass die Ebenheit quadratisch mit der Substratdicke und der betrachteten Fläche – und linear mit der Beschichtungsdicke zusammenhängt. D.h. es gilt zuerst zu prüfen, ob die notwendige Ebenheit durch eine kleinere Apertur oder ein dickeres Substrat erreicht werden kann. Falls das nicht zutrifft, kann die Beschichtungsdicke effektiv reduziert werden, indem die Beschichtung auf Vorder- und Rückseite verteilt wird, wobei dies die Kosten in die Höhe treibt aufgrund der längeren Beschichtungszeit. Alternativ kann die Beschichtungsdicke durch ein einfacheres Design reduziert werden – allerdings auf Kosten der spektralen Leistung (Steilheit von Kanten, Blockung, etc.).

Abb. 4:  © Alluxa

Dickes Substrat

Der nächstliegende Schritt um den Wellenfrontfehler zu verringern, ist die Verwendung von dickeren Substraten (wie bei der Herstellung von Spiegeln), z.B. 3 mm oder sogar 5 mm dicke Substrate. Das hilft – hat allerdings den Haken, dass die Strahlenteiler besondere Halter benötigen und einen größeren Versatz des transmittierten Strahls haben, der beachtet werden muss.

Gegenbeschichtung auf der Rückseite

Eine weitere, gängige Kompensation der Spannungen ist es, die Beschichtung in zwei Teile zu splitten und den Strahlenteiler vorne und hinten zu beschichten. Damit erzeugt man eine Gegenspannung und der Strahlenteiler ist in der Summe flacher, als wenn die ganze Beschichtung auf einer Seite wäre. Hier muss man allerdings vorsichtig sein, da aufgrund der zweiten Beschichtung auf der Rückseite spektrale Anteile auf der Rückseite reflektiert werden und zu einem „Ghost-Effekt“ führen können. In der Realität entstehen dann mehr oder weniger intensive Doppelbilder. Wenn man es gezielt einsetzt und die beiden Spektren von der Vorder- und Rückseite bekannt sind, kann man diese Technik ohne Nachteile verwenden.

Spezielle Beschichtungsverfahren

Mit speziellen Beschichtungsanlagen ist es möglich, die Oberflächenspannungen weitestgehend zu reduzieren und sehr flache Strahlenteiler mit einer Standarddicke von 1 mm zu produzieren. Allerdings können mit der Rahmenbedingung der Ebenheit nicht beliebig viele Schichten aufgetragen werden, so dass die spektrale Kante zwischen Reflexion und Transmission nicht beliebig steil sein kann. Damit sind die Strahlenteiler nicht für alle Anwendungen geeignet, da sich teilweise das Nutzsignal spektral sehr nah an der Anregung befindet (z.B. Raman).

Montage von flachen Strahlenteilern

Superflache Strahlenteiler herzustellen und zu vermessen ist das eine – sie so zu verbauen, dass die Ebenheit am Ende noch gewährleistet ist, ist das andere. Wenn auf den Strahlenteiler beim Verbauen in einen Filterwürfel ungünstige Montage-Spannungen durch Kleben oder Klemmen wirken, kann dies den Strahlenteiler verformen und damit für die Anwendung im schlimmsten Fall untauglich machen. Dies gilt besonders bei den hochauflösenden Mikroskopietechniken wie TIRF, STORM, PALM, GDSIM, STED, MINFLUX, etc.

Wenn Sie von unserer langjährigen Erfahrung diesbezüglich profitieren wollen, können wir die Filter-Montage gerne für Sie übernehmen:

Filter-Montage durch AHF

Anwendungen und Spezifikationen von Strahlenteiler (Strahlteiler)

Anwendung Substratdicke
(mm)
Krümmungsradius
(m)
Reflektierter Wellenfrontfehler (RWE)
bei 632,8 nm, PV
Max. Strahldurchmesser
(mm)
– nicht bildgebend
Max. Strahldurchmesser
(mm)
– bildgebend
STED, TIRF, PALM, STORM  3 ~ 1275 < 0,2 λ 22,5 37,0
dito 1 ~ 255 < 1 λ 10,0 16,7
Bildgebende Reflexion
(Image Splitter) 
3 ~ 1275 < 0,2 λ 22,5 37,0
dito 1 ~ 100 < 2 λ 6,3 10,0
Laser (Konfokal, Multiphoton) 1 ~ 30 < 6 λ 2,5 6,0
Standard Epi-Fluoreszenz 1 ~ 6 >> 6 λ NA NA
Quelle: Semrock Optical Filters – IDEX Health & Science


Die Tabelle gibt eine Orientierung, welche Ebenheit für einen Strahlenteiler je nach Anwendung benötigt wird. Erfahrungsgemäß ist bei der STED Mikroskopie und der allgemeinen Konfokal Mikroskopie die Verwendung von Strahlenteilern mit einer kleineren PV bzw. Krümmungsradius Spezifikation ratsam.

In der Praxis werden in der STED Mikrokopie 5 bzw. 6 mm dicke Strahlenteiler eingesetzt. Dabei fällt auf, dass die mögliche freie Apertur bzw. der maximale Strahldurchmesser für nicht bildgebende Strahlen kleiner ist als für bildgebende Strahlen. Das ist im ersten Moment kontraintuitiv, da die bildgebenden Strahlen die Ortsinformation der Probe zusätzlich enthalten, im Gegensatz zu den nicht bildgebenden Strahlen. Der Grund dafür liegt in den unterschiedlichen Grenzkritieren. Bei den nicht bildgebenden Strahlen liegt das Rayleigh Längen Kriterium (s.u.) zugrunde und bei den bildgebenden Strahlen das Airy Disk / Rayleigh Kriterium.

Nicht bildgebende Strahlen

Nicht bildgebende Strahlen beinhalten primär die spektrale Information und die jeweilige Intensität (die Zeit könnte man noch mit reinnehmen, ist aber nicht oft der Fall). Die Probe wird gerastert und das Bild im Nachhinein anhand vieler Punktinformationen im Rechner zusammengesetzt. Das ist z.B im Konfokalmikroskop (LSM) und im STED Mikroskop der Fall. Das Rayleigh Längen Kriterium besagt, dass der Fokusversatz aufgrund des reflektierten Wellenfrontfehlers weniger als eine Rayleigh Länge sein muss. Nicht zu verwechseln mit dem Rayleigh Kriterium, das zwei Bildpunkte voneinander trennt (siehe bildgebende Strahlen). Dabei gilt zu beachten, dass die Rayleigh Länge abnimmt mit größerem Strahldurchmesser (bzw. NA).

Wenn man nun den Strahldurchmesser gegenüber dem maximalen Wellenfrontfehler (bzw. der minimalen Ebenheit, welche proportional dazu ist) aufträgt, ergibt sich folgendes Diagramm:

Abb. 5:  © Semrock Optical Filters – IDEX Health & Science

Abb. 6:  © Semrock Optical Filters – IDEX Health & Science

Bildgebende Strahlen

Bildgebende Strahlen enthalten die Information der nicht bildgebenden Strahlen, plus der Ortsinformation (x/y-Achse) jedes Punktes (Bild). Hierbei ist entscheidend, ab wann zwei Punkte als getrennt wahrgenommen werden können (Auflösungsvermögen). Das Rayleigh Kriterium betrachtet dabei zwei Beugungsscheibchen/-bilder (Airy Disks) mit gleicher Farbe und Helligkeit und dessen Beugungsringe. Das Auflösungsvermögen entspricht dann dem Abstand der beiden Beugungsbilder 0. Ordnung, die sich gerade nicht mehr überlappen (Quelle: Universität Wien: "Lichtmikroskopie online")

Das Auflösungsvermögen kann umgangssprachlich auch mit der Bildschärfe verglichen werden. Im folgenden Schaubild wird der Einfluss der Ebenheit eines Strahlenteilers (Krümmungsradius m) auf die Bildschärfe ersichtlich:

Abb. 7:  © Semrock Optical Filters – IDEX Health & Science

Das Airy Disk / Rayleigh Kriterium besagt, dass die Vergrößerung des Strahldurchmessers aufgrund des reflektierten Wellenfrontfehlers nicht größer als der 1,5 fache Airy Disk Durchmesser sein darf. Bei einem konkav/konvex gekrümmten Strahlenteiler ist der maximale bildgebende Strahldurchmesser abhängig von dem Wellenfrontfehler (PV/inch) bzw. der Ebenheit. Daraus ergibt sich folgendes Diagramm, aus welchem auch abhängig von dem eigenen Strahldurchmesser der maximale Wellenfrontfehler (PV/inch, und daraus die Ebenheit) abgeleitet werden kann.

Einsatzgebiete von Strahlteilern

Strahlenteiler (Strahlteiler) für die Epi Fluoreszenz Mikroskopie

In der klassischen Epi-Fluoreszenz Mikroskopie wird das nicht kohärente Anregungslicht über den Strahlenteiler auf die Probe reflektiert und das Fluoreszenzbild durch den Strahlenteiler transmittiert. Die dabei entstehenden Abweichungen vom Strahlenteiler können i.d.R. vernachlässigt werden, da die Spot Größe und Tiefe der Anregung nicht kritisch ist und die Probe flächig angeregt wird. Der Einfluss des transmittierten Wellenfront Fehlers auf das Fluoreszenz Bild ist i.d.R. auch marginal und nicht relevant.

Fazit: Es können Standard Strahlenteiler verwendet werden, ohne dass die Qualität der Anwendung beeinträchtigt wird.

Epi-Fluoreszenz Strahlenteiler bei AHF


Strahlenteiler (Strahlteiler) für die TIRF Mikroskopie

In der TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) Mikroskopie wird das evaneszente Feld eines total reflektierten Anregungsstrahls (meist Laser) genutzt, um die Probe in einem sehr begrenzten (exponentiell abfallenden) Bereich hinter der Grenzschicht anzuregen (100–200 nm). Damit grenzt man den Bereich stark ein der fluoreszieren kann und erhält damit eine selektive Bildinformation. Abweichungen vom idealen Strahlengang können dazu führen, dass das Anregungslicht nicht mehr vollständig total reflektiert wird, sondern auch in die Probe mit eindringt. Da das evaneszente Feld exponentiell abfällt und die Totalreflexion winkelabhängig ist, ist die Methode sehr fehleranfällig (siehe Bild: Laser an der Wand). Weitere Informationen finden Sie in unserem » Artikel über TIRF-Mikroskopie.

Fazit: Es müssen sehr flache Strahlenteiler verwendet werden, um den Wellenfrontfehler zu minimieren.


Strahlenteiler (Strahlteiler) für die STED Mikroskopie

STED steht für „Stimulated Emission Depletion“ und ist ein Verfahren in der Fluoreszenz Mikroskopie, bei dem das Beugungslimit umgangen wird und dadurch eine Bildauflösung kleiner 40 nm möglich ist. Für die Bildgebung wird die Probe, wie bei einem Konfokalmikroskop abgerastert und das Bild nachträglich aus den Bildpunkten zusammengefügt. Der Trick bei der Sache ist, dass zusätzlich zum Scan-Laser (zur Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs) ein zweiter Laser verwendet wird, der die Form eines „Donuts“ (Ring mit Loch in der Mitte) hat und auf die gleiche Stelle fokussiert wird. Der „Donut“ mit der Fluoreszenzwellenlänge sorgt nun dafür, dass die Fluorophore in der Probe „abgeregt“ werden (wieder in den Grundzustand versetzt) und nicht mehr fluoreszieren können. Übrig bleiben die Fluorophore im Zentrum des „Donut“-Rings, deren Fluoreszenzintensität gemessen und für die Bildgebung verwendet werden.

Fazit: Da die Form des Anregungspunktes und des „Donuts“ elementar sind, ist es grundlegend wichtig, ebene Strahlenteiler zu verwenden.