Fluoreszierende Objektträger von Argolight zur Mikroskopkalibrierung

Vielleicht kennen Sie das ja: Sie wollen ein Experiment mit einem Fluoreszenzmikroskop reproduzieren und trotz genauer Anweisungen will es nicht funktionieren. Hier sind die Argolight Kalibrierungssysteme die Lösung, um Unsicherheiten auf der instrumentellen Seite auszuschließen.

Von Dr. Jakob Bierwagen, AHF analysentechnik AG

Der einzige Weg, um ein Fluoreszenzsystem zu kalibrieren und zu monitoren, ist, ein perfekt reproduzierbares Vorlageobjekt zu verwenden, dessen Struktur bekannt und stabil ist. Die Argolight Slides besitzen in Glas eingebrachte, stabil fluoreszierende Strukturen, deren Größe von sub-Mikrometer bis in den Zentimeterbereich gehen. Die fluoreszenten Strukturen werden durch einen optischen Prozess in das patentierte Glas eingebracht. Das Glasstück selbst ist in einen Metallträger gefasst, der die gleichen Dimensionen wie ein Standardmikroskopie-Slide hat. Dadurch vereinfacht sich die Handhabung. Die Kalibrierungsstrukturen sind z.B. konzentrische Kreise, ähnlich einem Fadenkreuz, mit denen die Bildverzerrung gemessen wird bzw. unterschiedlich helle Flächen, mit denen die Intensitätsreaktion gemessen wird. In Kombination mit der Auswertesoftware Daybook 2, die auch eine integrierte Datenbank beinhaltet, liefert Argolight eine vollständige Lösung für das Qualitätsmanagement von Fluoreszenzsystemen. Verschiedene Ausführungen stehen dabei zur Auswahl.

Kalibrierungsprozess

Für die Kalibration nimmt man zuerst, wie bei einer normalen Probe, die verschiedenen Strukturen unter den gewünschten Parametern auf. Anschließend werden die Bilder in die Auswertungssoftware geladen und die Meta-Daten wie Beleuchtungszeit und Detektionskanal übernommen und archiviert. Die ausgewerteten Daten werden einerseits gespeichert, wodurch sie für spätere Vergleiche zur Verfügung stehen und man die Langzeitstabilität seines Mikroskops verfolgen kann, andererseits geben sie Hinweise für die Verbesserung der Bildqualität. So ist z.B. schnell zu erkennen, ob der Sichtbereich gleichmäßig ausgeleuchtet ist. Weitere Parameter sind chromatische Aberration, (Wieder-) Positionierungsgenauigkeit sowie der xyz-Drift der Stage, die xyz-Auflösung, Bildverzerrung, Auflösung sowie die spektrale Reaktion des Gerätes. Anwendung finden die Slides z.B. in der Mikroskopie, aber auch in pharmazeutischen Unternehmen, die High-Throughput-Screening mit Fluoreszenzgeräten durchführen. Mit einem speziellen Argo-Power-Slide kann man zudem die absolute Beleuchtungsintensität messen und damit auch die absolute Detektionsperformance des Mikroskops ermitteln.

Fluoreszierende Strukturen

Die in das Glas eingebrachten fluoreszierenden Strukturen sind vollkommen inert und können in Größe, Form und Intensität beeinflusst werden. Das Basiselement aller Strukturen ist ein leerer, offener Zylinder, dessen Länge (FWHM) von 0,5 bis 10μm und Durchmesser
(FWHM) von 0,5 bis 2μm variabel ist. Dabei kann auch die Wandstärke zwischen 120 bis 550nm eingestellt werden. Ein 2D-Schnitt durch den Zylinder ist dann ein Ring mit den entsprechenden Dimensionen. Ausgehend von diesem Grundelement ist die Erzeugung
beliebiger 3D-Strukturen möglich, auch gerade, runde oder andere, komplexere Trajektorien können in unterschiedlichen Tiefen und Fluoreszenzintensitäten in das Material geschrieben werden. Spektral lassen sich die Strukturen von 325 bis 650nm anregen, wobei die Anregungseffizienz zu längeren Wellenlängen hin abnimmt. Das Emissionsspektrum beginnt bei ca.15nm rotverschoben zur Anregung und ist bis ca. 800nm nachweisbar. Die stabile und reproduzierbare Fluoreszenzlebensdauer liegt im unteren ns-Bereich. Die Stabilität der Strukturen wurde ausgiebig getestet. So wurde das Glas z.B. sechs Monate bei 100°C gelagert, ohne zu altern. Auch nach über 5.000 Stunden Beleuchtungszeit wurde kein Bleichen festgestellt, und selbst der über acht Jahre alte Prototyp ist immer noch verwendbar.

Ausblick

Zurzeit gibt es noch keinen international anerkannten Kalibrationsstandard für Fluoreszenzmikroskope. Argolight arbeitet mit Partnern, um diesen zu entwickeln. Hierfür werden die Mikroskophersteller, die NIST, aber auch die ISO-Organisation und andere nationale Institute für physikalische Standards mit einbezogen, um gemeinsam einen Prozess für die Kalibration zu entwickeln. AHF analysentechnik ist Exklusiv-Partner von Argolight für Deutschland und Österreich, des weiteren auch mit Vertrieb in die Schweiz.

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